酶联免疫吸附法（ELISA）原理与分类

更新时间：2024-06-25

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原理：

酶标抗体法，又名酶联免疫吸附法（ELISA），利用酶标记抗原或抗体以检测相应抗原或抗体的一种免疫学标记技术。其基本原理是使抗原或抗体结合到某种固相载体表面，并保持其免疫活性，而相对应的抗体或抗原与某种酶连接成酶标抗体或抗原，酶标抗体或抗原既保留了免疫活性可以与固相载体表面的抗原或抗体结合，又保留了酶活性能够以酶为检测信号，加入酶反应的底物后，底物被酶催化为有色产物，产物的量与受检抗体或抗原的量成比例，故可根据颜色深浅来定性或定量分析。酶标抗体法具有灵敏性强，特异性高，重复性好，检测速度快的特点，尤其适用于大批量样本检测，是国际认可的标准化诊断方法。

基本操作步骤：

包被—封闭—加样—孵育一抗—洗涤—孵育二抗—洗涤—显色—终止—读数

分类：

依据检测目的不同，酶标抗体法有间接法，双抗体夹心法，竞争法和抗体捕获法等。

1.间接法

主要是利用酶标记的抗抗体检测已与固相结合的受检抗体，是检测抗体常用的方法。将特异性抗原与固相载体连接，形成固相抗原，洗涤除去未结合的抗原及杂质。加入稀释的受检样品（如血清），样品中特异性抗体与抗原结合，形成固相抗原抗体复合物。经洗涤后固相载体上只留下特异性抗体。其他免疫球蛋白及杂质由于不能与固相抗原结合，在洗涤过程中被洗去。加入酶标抗抗体与固相复合物中的抗体结合，从而使该抗体间接地标记上酶。洗涤后固相载体上的酶量就代表特异性抗体的量。最后加底物显色，依据颜色深度代表标本中受检抗体的量。

2.双抗体夹心法

检测抗原常用的方法。将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤除去未结合的抗体及杂质。加受检标本，使之与固相抗体接触反应一段时间，让标本中的抗原与固相载体上的抗体结合，形成固相抗原复合物。洗涤除去其他未结合的物质。加酶标抗体使固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合，洗涤未结合的酶标抗体，此时固相载体上带有的酶量与标本中受检物质的量正相关。夹心式复合物中的酶催化底物成为有色产物。根据颜色反应的程度进行该抗原的定性或定量。

3.竞争法

可用于测定抗原，也可用于测定抗体。以测定抗原为例，受检抗原和酶标抗原竞争与固相抗体结合，因此结合于固相的酶标抗原量与受检抗原的量呈反比。将特异抗体与固相载体连接，形成固相抗体，洗涤后加入受检标本和一定量酶标抗原的混合溶液，使之与固相抗体反应。如受检标本中无抗原，则酶标抗原能顺利地与固相抗体结合。如受检标本中含有抗原，则与酶标抗原以同样的机会与固相抗体结合，竞争性地占去了酶标抗原与固相载体结合的机会，使酶标抗原与固相载体的结合量减少。参考管中只加酶标抗原，孵育后酶标抗原与固相抗体的结合可达最充分的量。洗涤后加底物显色，参考管中由于结合的酶标抗原最多，故颜色最深。参考管颜色深度与待测管颜色深度之差代表受检标本抗原的量。待测管颜色越浅，表示标本中抗原含量越多。

4.抗体捕获法

血清中针对某些抗原的特异性IgM常和特异性IgG同时存在，后者会干扰IgM抗体的测定。因此测定IgM抗体多用捕获法。先将所有血清IgM（包括异性IgM和非特异性IgM）固定在固相上，去除IgG后再测定特异性IgM。将抗IgM抗体连接在固相载体上，洗涤后加入稀释的血清标本，洗涤后加入特异性抗原，洗涤后再加入酶标抗体，最后洗涤加底物显色。

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